Comprar quitosano 43

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Informes grado de desacetilación del quitosán valores: la influencia de los métodos analíticos. Hung Seng Ch'ng Hunza Labs Ltd. Innovación y Consultoría Centre, Universidad de Ciencias de Malasia, 11800 Penang, Malasia. Recibido el 22 de agosto de 2001, Revisado el 9 de febrero de 2002, ha aceptado 21 sin de agosto de de 2002 Abstracto PROPÓSITO . Para investigar y comparar el efecto de tres métodos analíticos, Titulometría bromuro de hidrógeno (HBr volumetría), espectroscopia infrarroja (espectroscopia IR), y primero derivado espectrofotometría UV (FDUV-espectrofotometría) en la determinación del grado de desacetilación (DD) de quitosano. MÉTODOS. Se seleccionaron tres muestras de quitosano diferentes para la volumetría HBR DD cuantificación empleando, espectroscopia IR con las muestras en las formas de disco de KBr (en proporciones de 1: 2 y 1: 3) y la película delgada (concentraciones de 0,5 por ciento y 1 por ciento), y espectrofotometría FDUV-. RESULTADOS. Los valores medios de las muestras DD quitosano obtenidos por HBr Titulometría fue significativamente menor (p 0,05). Además, los valores de las muestras DD quitosano purificadas y no purificadas secaron usando liofilizador no fueron significativamente diferentes a excepción de Chit-S2. CONCLUSIÓN. Los valores de DD de quitosano fueron muy afectados por los métodos analíticos empleados. Por lo tanto, hemos propuesto que el método de cuantificación para DD También se debe declarar al informar el valor DD de la muestra de quitosano. Introducción El quitosano es un polisacárido natural que comprende copolímeros de glucosamina y N acetilglucosamina, y se puede obtener por la desacetilación parcial de la quitina, del caparazón de crustáceos, el segundo polímero natural más abundante después de la celulosa (1, 2). Chitosan ha sido ampliamente utilizado en muy diversos campos, que van desde la gestión de residuos de la elaboración de alimentos, medicina y biotecnología (3). Se convierte en un material interesante en aplicaciones farmacéuticas (1) debido a su biodegradabilidad y biocompatibilidad (4), y baja toxicidad (5). Chitosan ha encontrado una amplia aplicabilidad en dispositivos farmacéuticos convencionales como un excipiente de formulación potencial (6). El uso del quitosano en la novela de administración de fármacos como mucoadhesivo (7), péptido (8) y la entrega de genes (9), así como potenciador oral (10) han sido reportados en la literatura. El quitosano presenta una miríada de acciones biológicas tales como hipocolesterolémico, antimicrobiana y propiedades de cicatrización de heridas (6, 11). Desde el quitosano es una nueva sustancia, es importante llevar a cabo la normalización precisa para sus aplicaciones farmacéuticas y biomédicas como otras sustancias auxiliares (12). Chitosan puede ser caracterizado en términos de su calidad, propiedades intrínsecas (pureza, peso molecular, viscosidad y grado de desacetilación) y formas físicas (13). Además, la calidad y las propiedades de producto de quitosano puede variar ampliamente debido a muchos factores en el proceso de fabricación pueden influir en las características del producto final (14). El quitosano es comercialmente disponible de un número de proveedores en varios grados de pureza (7), el peso molecular y el grado de desacetilación (15). Se informó de que el grado de desacetilación es una de las características químicas más importantes (14), que podrían influir en el rendimiento del quitosano en muchas de sus aplicaciones (16, 17). Además, el grado de desacetilación, que determina el contenido de grupos amino libres en los polisacáridos (14), se puede emplear para diferenciar entre quitina y quitosano. Por ejemplo, la quitina con un grado de desacetilación del 75% o más en general, que se conoce como quitosano (18). El proceso de desacetilación implica la eliminación de grupos acetilo de la cadena molecular de la quitina, dejando detrás de un grupo completo amino (-NH 2) y la versatilidad de quitosán depende principalmente de este alto grado químicas grupos amino reactivos. Hay métodos disponibles para aumentar o disminuir el grado de desacetilación. Por ejemplo, aumentar, ya sea en la temperatura o la fuerza de solución de hidróxido de sodio podría mejorar la eliminación de grupos acetilo de la quitina, que resulta en una gama de moléculas de quitosano con diferentes propiedades y por lo tanto sus aplicaciones (17, 19). Dado que el grado de desacetilación dependía principalmente del método de condiciones de purificación y de reacción (17, 18), es por lo tanto esencial para caracterizar quitosano mediante la determinación de su grado de desacetilación antes de su utilización en la etapa de desarrollo de los sistemas de administración de fármacos. Varios métodos han sido reportados para la determinación del grado de desacetilación del quitosano. Estos métodos incluyen ensayo de ninhidrina (20), la titulación potenciométrica lineal (21), la espectroscopia de infrarrojo cercano (22), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (23), hidrógeno Titulometría bromuro de (17, 24), la espectroscopia de infrarrojos (24-26), y primero espectrofotometría UV derivada (27, 28). Algunos de los métodos son demasiado tediosa y costosa para análisis de rutina (espectroscopia de resonancia magnética nuclear), o destructiva a la muestra (ensayo de ninhidrina). Por otra parte, muchos limitar el rango de grado de desacetilación en que sean aplicables (24). Últimamente, la primera derivada espectrofotometría UV fue defendido por el grado de desacetilación determinación (27, 28). A partir de la literatura, los valores de DD de la quitosana parecían estar altamente asociada con los métodos de análisis utilizados. Un amplio estudio para examinar tres métodos analíticos utilizados comúnmente, primera derivada espectrofotometría UV (FDUV-espectrofotometría), aún no se han reportado volumetría bromuro de hidrógeno (HBr) y espectroscopia infrarroja (IR) en la determinación del grado de desacetilación quitosano. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue investigar la influencia de los métodos de análisis sobre el grado de desacetilación quitosano valor (DD). Materiales y métodos materiales Se utilizaron tres muestras de quitosana disponibles comercialmente. Dos muestras de quitosano, Chit-S1, Lote # 83H0036, grado práctico de conchas de cangrejo y Chit-S2, Lote # 116H1465, a partir de conchas de cangrejo, mínimo 85% desacetilado, fueron adquiridos de Sigma Chemical, St. Louis, EE. UU., mientras que otro quitosano muestra, Chit-F, Código # 22743, de alto peso molecular, se obtuvo de Fluka Biochemica, Buchs, Suiza. ácido acético glacial, ácido bromhídrico (47-50%) y tetraborato de sodio fueron adquiridos de Sigma Chemical, St. Louis, EE. UU.. D-glucosamina clorhidrato y N-acetilglucosamina se compraron de Fluka, Buchs, Suiza. El hidróxido de sodio se adquirió de química RM, Essex, solución U. K. Amoníaco 33% se obtuvo de May y Baker, Inglaterra. El metanol GR se adquirió de Merck, Darmstadt, Alemania. Todos los demás reactivos y disolventes utilizados fueron de grado reactivo analítico. Los materiales se utilizaron tal como se recibieron. Análisis de hidrógeno Bromuro volumétrica El método propuesto por Sabnis y el bloque (29) se emplea después de una ligera modificación. 0,5 g de quitosano se disolvió en 100 ml de ácido bromhídrico recién preparada 0,2 M. a continuación, se añadió ácido bromhídrico concentrado 9M (50 ml) a la solución de quitosana con agitación vigorosa para precipitar la sal de hidrobromuro. La suspensión resultante se centrifugó a 2.000 rpm durante 30 min y se descartó el sobrenadante. La sal bromhidrato de quitosano se separó por filtración y se lavó varias veces con una mezcla de metanol y éter dietílico (1:, v / v 1) hasta que el filtrado fue neutro al tornasol. La humedad residual en la sal de hidrobromuro de quitosano se eliminó por agitación durante seis horas en éter dietílico anhidro. Después de la filtración final, el precipitado se secó en un desecador de vacío durante 12 horas para producir una sal de bromhidrato de quitosano blanco. Una sal de hidrobromuro exactamente pesada (aproximadamente 0,2 g) de quitosano se disolvió en 100 ml de agua destilada. La solución resultante (20 ml) se tituló frente a una solución de hidróxido de sodio 0,1 M estandarizado utilizando fenolftaleína como indicador. Los moles de álcali neutralizado correspondían a los moles de ácido bromhídrico presente, que correspondía a la mol de unidades de glucosamina de quitosano inicialmente presentes en la solución, facilitando de este modo el cálculo del grado de desacetilación de muestras de quitosano. El análisis infrarrojo espectroscópico Se estudiaron muestras de quitosano preparadas en las formas de bromuro de potasio disco (KBr) y el cine. El disco de KBr se preparó de acuerdo con el método de Sabnis y Block (29) con ligeras modificaciones. Aproximadamente se mezclaron 40-60 mg de polvo de quitosano y 120 mg de KBr y se trituraron con mortero de ágata y mano de mortero durante 10 min. Aproximadamente se compactaron 40 mg de la mezcla usando una prensa hidráulica IR a una presión de 8 toneladas durante 60 s. El disco se acondicionó en un desecador coloca en un horno a 80ºC durante 16 hr antes del análisis. Las películas de quitosano se prepararon de acuerdo con el método mencionado por Baxter et al. (17) con ligeras modificaciones. películas de quitosan se prepararon mediante colada 0,5 y 1,0% w / v de quitosano en soluciones de ácido acético 1%, seguido por secado en un horno a 60ºC durante 16 h antes de la exploración. Los espectros de las muestras de quitosano (en las formas de disco y la película de KBr) se obtuvieron usando un I. R. Instrumento (MB-100, Bomem Hartmann Braun, Quebec, Canadá) con un rango de frecuencia de 4000-400 cm-1. El grado de desacetilación (DD) de las muestras de quitosano se calculó utilizando dos líneas de base diferentes, la línea de base (a), que fue propuesto por Domszy y Roberts (24) y la línea de base (b) por Baxter et al. (17). Las ecuaciones de cálculo para las dos líneas de base se dan a continuación: donde A 1655 y A 3450 fueron la absorbancia a 1655 cm -1 de la banda de amida-I como una medida del contenido de grupo N-acetilo y 3450 cm -1 de la banda de hidroxilo como un patrón interno para corregir la espesor de la película o para las diferencias en la forma de polvo concentración de quitosano. El factor `1.33 'denota el valor de la relación de A 1655 / A 3450 para quitosano completamente acetilado N-. Se supuso que el valor de esta relación era de cero para quitosano completamente desacetilado y no había una relación rectilínea entre el contenido de grupos N-acetilo y la absorbancia de la banda de amida-I (24). La línea de base (b) propuesto por Baxter et al. (17) se modificó a partir del método reportado por Domszy y Roberts (24). Las absorbancias de grupos amida e hidroxilo más pueden ser representados por las expresiones matemáticas simples como propone Sabnis y Block (29). donde DF 1 (para la línea de base `a ') o DF 2 (para la línea de base` b'), DE, AC y AB representan las alturas absolutas de las bandas de absorción de los grupos funcionales en sus respectivas longitudes de onda. La relación de absorbancia se calcula como sigue: Relación de absorbencia = (A 1655) / (A 3450) hidroxilo amida Primer análisis espectrofotométrico UV-Derivative El método descrito por Tan et al. (28) se utilizó después de algunas modificaciones. Una serie de N acetilglucosamina soluciones estándar de 0,005 - se prepararon 0,050 mg / ml en solución de ácido acético 0,01 M y su primera espectros derivados registrados. Se obtuvo el primero espectros derivado de soluciones de ácido acético a concentraciones de 0,01, 0,02 y 0,03 M usando un espectrofotómetro UV-VIS (Shimadzu 2100, Japón) en el intervalo de 250-190 nm. El punto de cruce por cero (ZCP) se determinó mediante la superposición de los espectros de estas soluciones. Se midió la distancia vertical desde ZCP para cada espectro solución de N acetilglucosamina, `H '. Una curva de calibración lineal se obtuvo representando gráficamente los valores de H contra el correspondiente concentración de N acetilglucosamina. Como la presencia de glucosamina podría dar lugar a un valor mayor `H 'para N acetilglucosamina, una curva de referencia se construyó para la corrección de este efecto (27). Se preparó un 0,1 mg de N-acetilglucosamina (GlcNAc) por ml de solución de ácido acético 0,01 M. Por otro lado, N-acetilglucosamina (% w / w) de diferentes concentraciones se preparó mediante la mezcla de diferentes proporciones de D-glucosamina (GlcN) y soluciones de GlcNAc. La altura del pico (H-valor en mm) de la solución GlcNAc pura (H 1) y las soluciones de diferentes porcentajes de GlcNAc (H 2) se midió desde el punto de cruce por cero. Los factores de corrección pueden derivarse de la curva de referencia, que se obtuvo mediante el trazado de la H 1 / (H 1 H + 2) frente a las correspondientes concentraciones de N-acetilglucosamina (% w / w). Antes del análisis, las muestras de quitosana se dividieron en dos porciones. Una porción se analizó tal como se recibió (no purificado), mientras que la otra porción se purificó adicionalmente usando el método descrito por Tan et al. (28). Las muestras de quitosano se subdividen a su vez en dos partes; una parte secó usando un horno a 80ºC durante 24 hr mientras que el otro usando liofilizador durante 24 horas. Acerca de 0,01 g de muestras de quitosano se disolvieron en 10 ml de solución de ácido acético 0,01 M y se diluyó hasta 100 ml con agua destilada. Se registró el primer espectro derivado de la muestra. La distancia vertical, valores de H (mm), se midió a partir ZCP y se obtuvo la contribución debida a cada acetilglucosamina N de la curva de calibración. La DD% de las muestras de quitosano desconocidos se determinó usando la siguiente ecuación: DD = 100 - [A / (W-204A) / 161+ A] X 100 donde `A 'es la cantidad de N-acetilglucosamina determinado / 204 y` W' es la masa del quitosano utilizado. Análisis estadístico Los resultados se presentan como media 0,05), se realiza entonces una prueba de Tukey-HSD. Por otro lado, los valores de DD obtuvieron utilizando dos líneas de base diferentes de análisis espectroscópico de IR se compararon mediante la prueba t de Student para muestras independientes. RESULTADOS Los valores DD calcularon utilizando diferentes métodos analíticos para las tres muestras de quitosana (Figuras 1A, 1B y 1C) fueron significativamente diferentes (p 0,05) para todas las tres muestras de quitosano, lo que indica que los valores de DD dependen del tipo de métodos de análisis altamente empleada. Los valores de DD se observó a ser la más alta si se calcula utilizando FDUV-espectrofotometría, seguido por espectroscopía IR usando la película, volumetría HBr y espectroscopia de IR, por último, el uso de disco de KBr. Figura 1A: grado de desacetilación del quitosano muestra (Chit-S1) Medido por BromideTitrimetry hidrógeno, espectroscopia infrarroja y la primera derivada espectrofotometría UV. Media ± DE, n = 3. Figura 1B: grado de desacetilación del quitosano muestra (Chit-S2) Medido por el bromuro de hidrógeno Titulometría, espectroscopia infrarroja y la primera derivada espectrofotometría UV. Media ± DE, n = 3. Figura 1C: grado de desacetilación del quitosano muestra (Chit-F) Medido por el bromuro de hidrógeno Titulometría, espectroscopia infrarroja y la primera derivada espectrofotometría UV. Media ± DE, n = 3. Los valores medios de las muestras DD quitosano obtenidos por HBr Titulometría fue significativamente menor (p 0,05). En el método espectroscópico de IR, se emplearon dos líneas de base diferentes para analizar los valores de DD muestras de quitosano, que se prepararon en dos formas físicas diferentes. Los espectros de IR con las respectivas líneas de base se ilustra en la Figura 2. Figura 2: I. R. espectro de quitosano que muestra las dos líneas de base ( `A 'y` b') para el cálculo de la absorbancia banda amida I de la relación A 1655 / A 3450. Para las muestras de quitosano preparadas en forma de pastilla de KBr, en proporciones de 1: 2 y 1: 3, los valores de DD de Chit-S1, Chit-S2, y Chit-F, entre las dos líneas de base diferentes fueron significativamente diferentes (p 0,05 ) entre la línea de base (a) y (b) tanto en las concentraciones de Chit-S1 y en 0,5% para Chit-S2, pero no al 1% para Chit-S2 y en ambas concentraciones de Chit-F. muestras de quitosano preparadas en forma de película no pueden ser afectados significativamente por la diferente línea de base como se observó ninguna tendencia consistente. De la prueba de Tukey-HSD, los valores medios DD de KBr en proporción 1: 2, KBr en proporción 1: 3, la película en el 0,5%, y la película en 1% calculados usando la línea de base (a), se encontró que eran significativamente diferentes a excepción entre KBr en una relación 1: 2 y KBr en una relación 1: 3 para Chit-F (p 0,05). Figura 3 muestra la primera derivada de los espectros de soluciones de ácido acético (0,01, 0,02 y 0,03 M), las normas de N-acetilglucosamina (,005-,050 mg / ml) y muestras de quitosano. Figura 3: En primer derivado de espectros UV de diversas soluciones estándar de N-acetilglucosamina (a = 0,005, b = 0,01, c = 0,02, d = 0,03, e = 0,04, y f = 0,05 mg / ml en ácido 0,01 M acético) , muestra de quitosano (S), y el punto de cruce por cero (ZCP). Cuando la primera espectros derivado de tres concentraciones diferentes de las soluciones de ácido acético se registraron contra el agua, se observó que todos los espectros ácido acético comparte un punto común en una longitud de onda de aproximadamente 202 nm, que se denota como punto de cruce por cero (28). La superposición de estos tres espectros permite la individualización exacta del punto de cruce por cero (ZCP) del ácido en 202 nm. La ZCP correspondió a la máxima N-acetilglucosamina en el eje de longitud de onda, y esto hace que la determinación de N-acetilglucosamina independiente de la gama de concentración de ácido acético generalmente encontrado con soluciones diluidas de quitosano (31). El coeficiente de correlación (r 2) entre `valores y concentraciones de N-acetilglucosamina (GlcNAc) H 'se calculó que era 0.998. La primera espectros derivado de muestras de quitosano desconocidos (S en la figura 3) se registraron. El `H '(mm) se midieron los valores de ZCP y la contribución debida a GlcNAc se obtiene a partir de la curva de calibración. Los datos experimentales mostraron que la presencia de glucosamina (GlcN) podría ofrecer un mayor valor `H 'para soluciones de N-acetilglucosamina de lo esperado. Muzzareli y Rochetti (27) reportaron que la presencia de GlcN contribuyó al valor del `H 'cuando el contenido de GlcNAc fue inferior al 10%. Por otra parte, los resultados producidos por Tan et al. (28) demostraron que este efecto era frecuente cuando la GlcNAc era 20%. En vista de estas discrepancias, una curva de referencia se construyó en el presente estudio como se muestra en la Figura 4. Se observó que la contribución de la glucosamina para el valor `H 'era prominente incluso cuando el contenido de GlcNAc estaba en 30%. Figura 4: curva de corrección para la determinación de N-acetilglucosamina. DISCUSIONES La variación en los valores de DD entre las tres muestras de quitosano utilizados en el estudio se prevé como su proceso de fabricación y la condición difiere de uno a otro. La dependencia de DD de la fuente y el método de purificación se ha informado en la bibliografía (17, 18). Otros grupos de investigación también informaron de la dependencia de los valores de DD del tipo de métodos analíticos utilizados (17, 27). Los valores variados de DD para el mismo lote de quitosano podrían atribuirse a diferentes preparación de la muestra, las condiciones experimentales, así como el tipo de instrumento utilizado y su sensibilidad (29, 32). El método de titulación HBr tiene la ventaja de que mide los grupos amina protonadas directamente. Además, no había problema de la falta de accesibilidad de los grupos amina durante la etapa de protonación como la sal se formó por precipitación de la solución con ácido (24). Dado que la base química de este método se basa en la reacción con el grupo amina, la presencia de contaminantes de proteína se mantuvo en la muestra durante el proceso de extracción podría interferir negativamente a los resultados. Durante la recuperación de la sal de quitosano HBr, el filtrado se lavó varias veces con una mezcla de metanol y éter dietílico hasta neutralidad al tornasol. El uso de papel de tornasol no podría indicar con precisión el valor real de pH neutro, lo que lleva a una falsa reflejo de una completa eliminación de HBr. Como resultado, la sal de quitosano HBr podría no estar completamente libre de HBr, que en última instancia afecta a los valores de DD de la quitosana. Además, el uso de fenolftaleína como indicador del punto final de la valoración del grupo amino también podría dar lugar a valores de DD inferiores. método espectroscópico de IR, el cual fue propuesto inicialmente por Moore y Roberts (25), se utiliza comúnmente para la estimación de los valores de DD quitosano. Tiene una serie de ventajas ya que es relativamente rápido y no requiere disolución de la muestra de quitosano en un disolvente acuoso (17, 29). Sin embargo, la espectroscopia IR es principalmente una línea de base utilizando un método de estado sólido para el cálculo de DD. Empleo de la línea de base diferente contribuiría inevitablemente a las variaciones en los valores de DD (17, 26). Por otra parte, la preparación de muestras, el tipo de instrumento utilizado y las condiciones puede influir en el análisis de la muestra (26, 29). Además, puede ser posible argumento para la elección de banda de absorción A3450 como un estándar interno como pueden surgir errores por el efecto de agua adsorbida en la intensidad de la banda de hidroxilo (24). El quitosano es de naturaleza higroscópica y se informó de que la capacidad de adsorción de humedad del quitosano disminuyó con un aumento de la desacetilación (32). Esto sugiere que las muestras que tienen mayor DD pueden absorber menos humedad que las personas con DD inferior. Por otra parte, los errores experimentales pueden ocurrir durante el pesaje de las muestras. Como tal, es esencial que las muestras bajo observación deben estar completamente seco (32). En el presente estudio, este se evitó acondicionado las muestras de quitosano en un desecador colocado en un horno de aire circulante a 80ºC durante 16 hr. En el caso de las películas, se lavó durante 3-4 veces con amoníaco metanólico para la desprotonación, seguido de lavado con agua destilada y finalmente con metanol. El proceso de desprotonación se prevé que sea completa ya que esto podría afectar negativamente a los valores de DD. Como tal, se puede concluir que las diferentes formas físicas contribuyen a diferentes valores de DD. En el método FDUV-espectrofotométrico, comparaciones utilizando la prueba de Tukey-HSD mostraron que los valores de las muestras DD Chit-S2 purificadas eran comparables y no significativamente diferente (p 0,05). Además, los valores de las muestras DD quitosano purificadas y no purificadas secaron usando liofilizador no fueron significativamente diferentes a excepción de Chit-S2. Por lo tanto, se puede sugerir que las muestras de quitosano utilizados en el presente estudio podrían ser de gran pureza y por lo tanto no pueden requerir purificación. El método espectrofotométrico FDUV-requiere sólo una pequeña cantidad de muestra y se basa en los reactivos simples y puede ser analizado mediante un espectrofotómetro de laboratorio común. Permite una simple, conveniente, ahorro de tiempo y es lo suficientemente sensible para detectar la concentración de GlcNAc tan bajo como 0,0005 mg / ml. en ácido acético 0,01 M. Los resultados obtenidos son bastante razonable con menos interferencia de contaminantes de proteínas, que proporciona una buena precisión y exactitud para el ensayo de los residuos de N-acetilglucosamina en quitosano. El uso de agua como un blanco de referencia evita la absorción de luz en el sistema óptico permitiendo así una mejor relación de señal a ruido. Por otra parte, el retroceso de la utilización de método FDUV-espectrofotométrico para la determinación de DD de quitosano fue que los resultados que dependen principalmente de los valores de H (mm) se obtuvieron manualmente, lo que parecían ser crudo y dependían en gran medida de operador. CONCLUSIONES Se puede concluir que los valores de DD fueron muy afectados por los métodos analíticos empleados. Por lo tanto, hemos propuesto que el método analítico utilizado para la cuantificación de los valores de DD debe indicar al informar sobre el DD de productos de quitosano. referencias Illum. L. Chitosan y su uso como un excipiente farmacéutico. Pharm Res. 15: 1326-1331, 1998. Nunthanid, J. Puttipipatkhachorn, S. Yamamoto, K. y Peck, G. E. Propiedades físicas y comportamiento molecular del quitosano películas. Drug Dev Ind Pharm. 27 (2): 143-157, 2001. Savant, V. y J. A. Torres Sociedad Americana de Chitoscience 1: 1-4, 1995. Borchard, G y Junginger H. 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